آشنایی با مفاهیم پایه در تکنیک ریل تایم Real time PCR

آشنایی با مفاهیم پایه در تکنیک ریل تایم Real time PCR

مفهوم سی تی Ct در ریل تایم Real time

اگر منحنی میزان تکثیر محصول در Real time یا PCR را بر حسب سیکل های PCR ترسیم گردد، می توان دریافت که به این منحنی  شامل سه فاز می باشد که عبارت است از:

مرحله اول: فاز Baseline region یا Linear phase می باشد. در این فاز میزان تکثیر محصولات به قدری نیست که سبب افزایش نور فلورسنت گردد. نور فلورسنت مشاهده در این فاز از cDNA، پرایمرها و رنگ های فلورسنت آزاد در محیط واکنش نشر می یابد بنابراین در این فاز میزان نور ساطع شده به صورت خطی می باشد.

مرحله دوم: فازهایExponential phase و Log liner phase: در این فاز میزان محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود بنابراین میزان محصولات به صورت نمایی افزایش می یابد.

مرحله سوم: فاز plateau phase : در این فاز، ترکیبات واکنش از بین می روند و دیگر محصولی تکثیر نمی شود بنابراین افزایشی در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود. به اصطلاح ریل تایم در این مرحله اشباع شده است.

✅✅تفسیر منحنی های ریل تایم در آنالیز نتایج ریل تایم

 این شکل منحنی تکثیر ژن YHZ2 را در دو نمونه مختلف ( به عنوان مثال سرطانی و نرمال ) در واکنش Real time pcr نشان می دهد. نمونه قرمز رنگ دارای الگوی بیشتر از ژن فوق نسبت به نمونه آبی رنگ در شروع واکنش می باشد.

بنابراین زودتر وارد فاز exponential می شود. نمونه قرمز رنگ در سیکل 15 و نمونه ابی رنگ در سیکل 17 وارد فاز exponential می شوند. چون نمونه قرمز رنگ زودتر به فاز exponential رسیده و دارای الگوی بیشتری است.

 می توان گفت که بیان ژن مورد نظر در نمونه قرمز رنگ بیشتر است. بنابراین هرچه قدر سیکلی که در آن میزان محصول ریل تایم وارد فاز exponential می گردد کمتر باشد. یعنی میزان الگوی اولیه (و به عبارتی بیان ژن) بیشتر بوده است.

حال می توان به صورت توافقی سیکلی که در آن محصولات وارد فاز exponential می شود را به عنوان سیکل مرجع در نظر گرفت و بگوییم در شکل بالا سیکل مرجع برابر نمونه قرمز رنگ برابر 15 و برای نمونه آبی رنگ برابر 17 است. 

در تکنیک real time به این سیکل مرجع به اصطلاح سیکل آستانه یا ( Ct (cycle of threshold گویند.